酵母菌发酵玉米皮制备菌体蛋白饲料

 玉米皮是玉米淀粉加工的主要副产物之一，大约占玉米总质量的12%，但玉米皮并未得到充分利用。发展微生物饲料蛋白是满足其需要的有效途径之一，并且玉米皮是该产业的首选原材料。利用酵母菌将玉米皮转化为优质饲料，旨在有效利用玉米皮的营养成分，为菌体蛋白饲料研究奠定基础。

　　1材料与方法

　　1.1 材料与试剂

　　1.1.1 试验原料

　　玉米皮购于市场。

　　1.1.2 菌种

　　毕赤酵母菌。

　　1.1.3 仪器与设备

　　高效液相色谱Water 1515；色谱柱：Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm id，9 μm）；RI 示差检测器；流动相：8 mmol/L H2SO4；进样体积：20 μL；流动相流速：0.5 mL/min；柱温：40 ℃。

　　1.2 试验方法

　　1.2.1 玉米皮成分的测定

　　纤维素、半纤维素含量、木质素含量、粗蛋白质含量、淀粉含量、脂肪含量以及酸水解法的测定。

　　1.2.2 酵母菌发酵玉米皮制备饲料蛋白

　　厌氧培养需取24 个30 mL 西林瓶，称取0.6 g 玉米皮，加入30 mL 蒸馏水；好氧培养需取24 个100 mL三角瓶（提前洗净，烘干），均称取0.6 g 玉米皮，加入30 mL 蒸馏水，盖胶塞，压铝盖后放入1.5 MPa，121 ℃压力锅中灭菌。在操作前，需先在超净工作台内杀菌30 min，再接入1.5 mL 酵母菌液（5%接菌量），置于25 ℃，150 r/min 的培养箱内培养菌种。每24 个瓶培养一个时间梯度，分别为24、48 h。观察不同培养时间和需氧情况对毕赤酵母菌体的影响。

　　1.2.3 微生物饲料中菌体浓度测定

　　将培养好的菌液置于振荡器上振荡5 min，使菌落脱离玉米皮。再将菌液倒入离心管中，3000 r/min 离心5 min。然后取上清液倒入比色皿中，置于分光光度计内，测定OD560。

　　1.2.4 微生物饲料中菌体数测定

　　由于原菌液浓度太大，给计数带来极大不便，故需预先稀释。本次所采用的稀释方法为：准备数个装有9 mL 蒸馏水30 mL 西林瓶，取1 mL 菌液添加到一个西林瓶中，依此梯度稀释5 个浓度，考虑到在操作过程中容易染菌，所以使用压过盖的西林瓶稀释，然后再利用血球板计数（沈萍等，2007）。

　　1.2.5 乙醇产量的测定

　　1.2.5.1 流动相配制

　　先用抽滤瓶抽取少量二次水，清洗抽滤瓶内壁，将清洗后的水倒出。再用抽滤瓶抽取约1000 mL 二次水后，再用超声波清洗器超声0.5 h，之后将其内的屈臣氏水加入到仪器储液瓶中。

　　1.2.5.2 标准样品的配置

　　乙醇2 g，72%的硫酸溶液5 mL，最后用二次水稀释到1 L。

　　1.2.5.3 样品溶液的配制

　　取培养好的菌液上清液950 μL 和50 μL 的10%的硫酸溶液加入到离心管中，4 ℃、15000 r/min 冷冻离心3 min。取出上清液置于另一离心管中，在上述同样的条件下再离心3 min，同样取出上清液经0.22 μm 水相过滤头过滤后置于进样瓶中，开始测样。

　　2结果与分析

　　2.1 玉米皮组分的分析

　　纤维素含量约为24.80%、半纤维素含量为47.68%、蛋白质含量为11.49%、淀粉含量为15.50%、脂肪含量为2.73%以及木质素含量为5.41%。这与Palmarola-Adrados 等（2005）的研究近乎相同。

　　2.2 酵母菌发酵玉米皮制备饲料蛋白

　　2.2.1 培养条件对菌种浓度的影响

　　厌氧条件下培养48 h 时，毕赤酵母菌体个数为2.31×107个/mL，相较于其他培养条件下，菌体浓度最高。

　　2.2.2 蛋白胨添加量对菌种浓度的影响

　　蛋白胨添加量为0g 时，毕赤酵母菌体数量为2.31×107个/mL，高于其他条件下培养的菌体数量。

　　2.2.3 纤维素与半纤维素的降解率

　　通过以上试验结果得知，在以玉米皮为底物时，厌氧培养48 h以后的菌液浓度明显高于24 h 的菌体浓度，厌氧条件下比好氧条件菌体浓度高，所以对该条件下培养后的剩余培养基中的纤维素和半纤维素成分进行测定，结果见表4。

　　经过微生物发酵，玉米皮中纤维素含量由16.40%变到6.22%，半纤维素含量由47.68%变到33.45%，说明毕赤酵母菌使玉米皮中的纤维素和半纤维素得以降解，供己所需，这可能是由于毕赤酵母菌产生某种可降解纤维素的酶。随着营养成分的不断增加，菌体浓度也会随之上升，与培养48 h 菌体浓度高于24 h 结论一致。

　　2.2.4 乙醇产量

　　经高效液相色谱测定，得到并无乙醇产生。

　　3讨论与小结

　　研究发现，玉米皮中含有丰富的纤维类物质，其中包括有30% ～ 50%的半纤维、10% ～ 20%纤维素以及微量的木质素。本试验结果表明，玉米皮中的纤维类物质含量很高，其中纤维素含量为16.40%，木质素含量为5.41%，而半纤维素含量高达47.68%，淀粉含量为15.50%，蛋白质含量为11.49%，在测量时会因原料的产地及种类不同略有差异。另外，毕赤酵母菌可以有效的发酵玉米皮，通过显微镜直接计数法和分光光度法均证实，在以玉米皮为底物时，厌氧培养48 h 以后的菌液浓度明显高于24 h 的菌体浓度，厌氧条件下比好氧条件菌体浓度高，这一现象可能是由于在起初接入毕赤酵母菌时，首先会利用一部分木糖维持，以致培养前期酵母处于延迟期生长，菌体数目增加不明显，同时木糖的消耗较少（陈晓萍，2009）；培养后期酵母处于指数生长期，酵母数急剧增加，同时开始消耗玉米皮中的纤维素。对剩余培养基成分进行测定发现，玉米皮中纤维素含量由16.40%降到6.22%，半纤维素含量由47.68%降到33.45%，远高于乔君毅（2008）研究的纤维素和半纤维素的降解率水平，达到了玉米皮成分得以转化的效果，在发酵过程中并未产生乙醇等影响饲料生产的有毒物质，符合其作为微生物饲料的基本要求。