动物新型疫苗研究进展(2)

    三、基因缺失疫苗

　　基因缺失疫苗是用基因工程技术将病毒致病性基因进行缺失，从而获得弱毒株活疫苗。用基因突变、缺失和插入的方法使病原体致弱，研制新的基因工程苗统称为重组疫苗。在微生物基因组插入或添加基因的方法制成的疫苗又称为基因添加疫苗。由于这些基因的变化，一般不是点突变(经典技术培育的弱毒株常是基因点突变)，故其毒力更为稳定，返突变机率更小，疫苗安全性好、不易返祖；其免疫接种与强毒感染相似，机体可对病毒的多种抗原产生免疫应答；免疫力坚实，免疫期长，尤其是适于局部接种，诱导产生黏膜免疫力，因而是较理想的疫苗。目前已有多种基因缺失疫苗问世，例如：(1)伪狂犬病毒基因缺失疫苗：该苗是通过研制伪狂犬病毒TK－缺失突变体使病毒致弱而获得，是1986年1月得到美国FDA批准从实验室到市场的第一个基因工程苗。在注册之前即已证明该疫苗无论是在环境中还是对动物都比野生型病毒和常规疫苗弱毒更安全。后来的伪狂犬病基因缺失苗所使用的缺失突变体，同时缺失TK基因和gpE、gpC和gpG三种糖蛋白基因中的一种。这种新一代的基因缺失苗产生的免疫应答很容易与自然感染的抗体反应区别开来，又称为“标记”疫苗，它有利于疫病的控制和消灭计划。(2)霍乱弧基因缺失疫苗：将霍乱弧苗A亚基基因中94％的A1基因切除，保留了A2和全部B基因，再与野生菌株同源重组筛选出基因缺失变异株，而获得无毒的活菌苗。(3)大肠杆菌基因缺失疫苗：将大肠杆菌LT基因的A亚基基因切除，将B亚基基因克隆到带有粘着菌毛(K88，K99，987P等)大肠杆菌中，制成不产生肠毒素的活菌苗。

　　四、多肽疫苗

　　多肽疫苗是用化学合成法或基因工程手段合成病原微生物的保护性多肽或表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。随着抗原表位作图技术研究进展，将抗原表位精确定位于某几个氨基酸残基成为可能。因此，如果某些线性中和抗原在完整蛋白中呈弱免疫原性，不利于制备疫苗时，则可通过基因工程技术，将这些线性抗原表位进行体外表达，使其抗原结构充分暴露，便可增强其免疫原性。当然，这些抗原表位单独存在时，其免疫原性常常较低，需通过下列3个途径加以改进：(1)与其他颗粒抗原(如HBsAg)进行融合蛋白表达；(2)将其与无毒力的结核菌素或霍乱毒素等细菌蛋白连接；(3)自身串联表达，形成复合肽。多肽疫苗的优点是可在同一载体上连接多种保护性肽链或多个血清型的保护性抗原肽链，这样只要一次免疫就可预防几种传染病。目前研制成功的多肽疫苗还不多，除口蹄疫合成肽疫苗外，还有乙型肝炎和疟疾合成肽疫苗的报道。该类疫苗的缺点是制造成本较高。

　　五、基因疫苗

　　基因疫苗包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前，研究较多的是DNA疫苗。它由编码能引起保护性免疫反应的病原体抗原的基因片段和载体构建而成。其被导入机体的方式主要是直接肌肉注射，或用基因枪将带有基因的金粒子注入。由于它不需任何化学载体，故又称裸DNA疫苗。但现在已有研究报道采用细菌载体等运送基因疫苗，即口服DNA疫苗，以期在黏膜局部免疫方面一展身手。

　　核酸疫苗于1989年由美国Wolff及Vical偶然发现，1992年Ulmer等将含流感病毒核心蛋白(NP)基因序列的重组质粒注射小鼠股四头肌，发现的确刺激产生了特异性的CTL，能保护小鼠抵抗不同流感病毒株感染，从而赋予疫苗全新的含义：(1)基因疫苗刺激机体产生免疫应答的过程类似于病原微生物感染或减毒活疫苗接种，其诱导产生的CTL反应可以抵抗和清除病原体感染。(2)以往对外膜蛋白容易变异的流感病毒、丙肝病毒(HCV)及免疫缺陷病毒(HIV)等缺乏有效疫苗，现在看来，它们的核心蛋白均非常保守，刺激机体产生的细胞免疫不仅可能预防不同病毒株的交叉感染，而且可能在治疗某些持续感染性疾病中有其积极的意义，所以基因疫苗克服了减毒活疫苗的可能返祖并导致人类和动物疾病及病毒发生变异而对新型的变异株不起作用的缺点。(3)基因疫苗诱导的CTL细胞免疫也可能用于抗肿瘤免疫。因此，DNA免疫的发现被视为疫苗业的一场革命，开辟了疫苗研究的新时代。

　　核酸疫苗除上述优点外，还具有以下明显优点：(1)外源基因在体内存在较长时间，不断表达外源蛋白，持续给免疫系统提供刺激，因此能够刺激产生较强和较持久的免疫应答。(2)核酸疫苗具有共同的理化特性，因此可以将含有不同抗原基因的质粒混合起来进行联合免疫。(3)质粒载体没有免疫原性，因此可以反复使用。

DNA免疫已经成为世界瞩目的防治传染病、肿瘤以及移植免疫治疗的新的研究热点，并取得很好研究进展

　　目前，DNA免疫已经成为世界瞩目的防治传染病、肿瘤以及移植免疫治疗的新的研究热点，并取得很好研究进展。国外已有多家公司，开通了介绍核酸疫苗的网站，如WWW．DNAvaccine.com。有关核酸疫苗论文每年数以千计，与核酸疫苗相关的专利已超过120项。足以看出核酸疫苗的广泛的应用前景。迄今，国外已有至少4种核酸疫苗被批准进入Ⅰ期临床试验，包括美国、瑞士和英国的艾滋病核酸疫苗、美国的成纤维细胞生长因子DAN疫苗。此外，乙型肝炎核酸疫苗也已经进行人体试验，疟疾核酸疫苗即将在尼日利亚做大规模临床试验。

　　对基于基因疫苗的基因免疫的顾虑和安全性考虑，包括是否与细胞染色体组整合，抗DNA免疫反应的可能影响；免疫耐受；免疫效力如何进一步提高等。相信随着研究的深化，基因疫苗一定会成为预防疾病的有效新武器。

　　六、转基因植物疫苗

　　转基因植物疫苗是把植物基因工程技术与机体免疫机理相结合，生产出能使机体获得特异抗病能力的疫苗。动物试验已证实，转基因植物表达的抗原蛋白经纯化后仍保留了免疫学活性，注射入动物体内能产生特异性抗体；用转基因植物组织饲喂动物，转基因植物表达的抗原递呈到动物的肠道相关淋巴组织，被其表面特异受体特别是M细胞所识别，产生黏膜和体液免疫应答。

目前用转基因植物生产基因工程疫苗主要有两种表达系统，一是稳定的整合表达系统，把编码病原体保护性抗原基因导入植物细胞内，并整合到植物细胞染色体上，整合了外源基因的植物细胞在一定条件下生长成新的植株，这些植株在生长过程中可表达出疫苗抗原，并把这种性状遗传给子代，形成表达疫苗的植物品系。二是瞬时表达系统，主要是利用重组植物病毒为载体将编码疫苗抗原的基因插入植物病毒基因组中，再用此重组病毒感染植物，抗原基因随病毒在植物体内复制、装配而得以高效表达。由于每个寄主植株都要接种病毒载体，所以瞬时表达不易起始，但可获得高产量的外源蛋白质。该类疫苗可按剂量食用以达到免疫接种的目的，所以，这类疫苗又称为食用疫苗。

　　用转基因植物已成功表达大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位(LTB)、霍乱弧菌肠毒素B亚单位(CTB)、乙型肝炎表面抗原

　　目前，用转基因植物已成功表达大肠杆菌热不稳定毒素B亚单位(LTB)、霍乱弧菌肠毒素B亚单位(CTB)、乙型肝炎表面抗原、兔出血症病毒VP60蛋白、口蹄疫病毒VP1蛋白、传染性胃肠炎病毒S蛋白、狂犬病病毒G蛋白和呼吸道合胞体病毒G蛋白、F蛋白等。此外，寄生虫的抗原如疟原虫抗原，亦在转基因植物中得到表达。动物试验表明，表达的抗原均能刺激产生特异性抗体应答，并产生一定的保护作用。 七、T细胞疫苗

T细胞疫苗是指将T细胞或体外T细胞表位多肽刺激产生的T细胞作为疫苗接种，用于治疗某些自身免疫疾病。但将依据MHC-I类分子特异的多肽结合基序(MHC binding motif)合成的多肽，在体外诱导产生的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)，用于治疗病毒性疾病，则是近几年的新思维、新设想。它将T细胞从过去应用为靶细胞转变成效应细胞，为T细胞疫苗的概念增添了新的内涵。T细胞疫苗是用多肽在体外诱导产生特异性CTL，后者被克隆、扩增、筛选和鉴定后，仅将MHC-I类限制的CD8+T细胞输入机体，诱导细胞免疫应答产生，从而解决了多肽疫苗存在的上述问题，而且直接回输CTL，可以人为地控制CTL的强度，避免其过度，导致大量受染肝细胞死亡，也可避免其过低，无清除病毒作用。

T细胞受体(TCR)疫苗是用TCR代替自身反应性T细胞进行接种，动物实验获得了较理想的免疫效应。TCR疫苗是T细胞疫苗的深化，也属于多肽疫苗。它在自身免疫性疾病治疗和抗移植排斥反应中有独到的优越性。

　　八、树突状细胞疫苗

　　树突状细胞是专职抗原递呈细胞，能有效地将抗原递呈给T淋巴细胞，从而诱导CTL活化。荷载抗原的树突状细胞具有疫苗的功能，故称树突状细胞疫苗。荷载抗原既可以是病毒抗原，也可以是肿瘤细胞，还可以是编码肿瘤抗原的基因。该类疫苗可以不依赖于CTL靶细胞，有较高的抗原递呈效率，可用于免疫治疗。