自2020年10月上海快灵发布“非洲猪瘟高敏PCR试剂盒”（下称高敏试剂盒）以来，其出色的灵敏度、敏感性、特异性及稳定性迅速被广大猪场实验室认可。随着荧光PCR相关技术的普及以及用户群体的增大，部分之前未被重视的问题也逐渐显露出来。本篇我们探讨下各厂家都讳莫如深的一个点——“假阳”问题，以及相应的解决方案。

    "假阳”问题，事实上在荧光PCR领域并不少见，而造成假阳产生的原因也是纷繁复杂：如操作不当污染、环境气溶胶污染或者试剂生产过程污染等。本文所要探讨的“假阳”，主要指因试剂特异性导致的假阳，换句话说，即文中所提的“假阳”，与操作者、仪器、环境均无关，只与试剂盒内的试剂有关。那么试剂盒中到底什么与“假阳”相关呢？纵观商业化的非瘟病毒PCR检测试剂盒，其中都会提及一个重要参数——特异性。

    何为特异性呢？在PCR扩增过程中，如果我们要扩增的非洲猪瘟DNA片段在整条DNA链上不止出现了一次，或者样品中混有的其他物种、细胞或病毒的DNA中含有类似的DNA片段，则可能会将其他片段扩增出来，那最后仪器显示出来的阳性结果就不一定是非瘟病毒DNA造成的，于是阳性结果也就变成了假阳。因此，通俗来说，特异性反应的是试剂盒能扩增出特定DNA片段的性能，特异性越低，则试剂盒扩增其他片段的概率就越大，即“假阳”几率更大。

    市售的众多非瘟病毒PCR检测试剂盒中，绝大多数厂商在宣传其试剂盒特异性时均会标注＞99%，最低也不会低于98%，快灵的高敏试剂盒也是如此，特异性可达到99.9%，属实是已经做到了极限，即使PCR技术发展至今，因为模板DNA的不确定，依然无法保证100%的特异性。也正因此，特异性，也就是假阳的问题是被大家忽视了。

    在服务客户的过程中，我们发现很多客户在进行非瘟病毒检测遇到极弱样本或疑似样本时，对于阳性场，往往遵循的是“宁杀错，不放过”，而对于阴性场，往往带来心理的恐慌，需要确认到底是不是阳性。的确，随着非瘟一波波的袭来，各检测单位的工作量都史无前例的倍增，再重新来一遍的全面复核，显然是对人力和成本的巨大考验。面对这样的大环境，快灵人陷入了沉思。

    “我们为什么要宁杀错？”

    “当真没有办法消除假阳么？”

    带着这样的问题，我们开始了新的一轮又一轮的尝试：提升试剂盒的灵敏度、将特异性由99%提升至99.9%……或许，我们可以把眼界放宽，不局限于单纯的扩增？

    于是，高敏试剂盒上市半年后，我们在高敏试剂盒基础之上研发出其“升级版”——快灵高敏试剂盒（熔解确认版）。

    快灵高敏试剂盒（熔解确认版），其性能参数与高敏试剂盒一致，我们同样保证其灵敏度、敏感性、稳定性、特异性处在行业顶尖水平，确保客户可以第一时间检测出阳性样本。包括其操作、扩增阶段也与高敏试剂盒别无二致，至此，我们可以把快灵高敏试剂盒（熔解确认版）等同于高敏试剂盒。详见表1：

    但，重点来了！快灵是怎么做到的？快灵高敏试剂盒（熔解确认版）突破性地使用了一个新的反应程序——熔解曲线。熔解曲线能鉴别不同的DNA片段，依靠的不是Ct.值，而是其特有的熔解峰，即Tm值，即使一个DNA片段中仅相差一个碱基，都能导致Tm值变动。依靠Tm值的判定就可以确认之前扩增阳性的非瘟样本是否为真的非瘟阳性，以此达到鉴别假阳，消除客户疑虑的目的。

非瘟新形势下，除了要求试剂盒更早的检测出阳性，更需要真正“精准”检测。快灵高敏试剂盒（熔解确认版）除了超高的灵敏度、特异性，更是“自带”熔解曲线，让假阳无处可藏，让弱阳“站得住脚”，真正做到打消客户疑虑，真正做到“不杀错、不放过”。

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